![]() Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву ![]() Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
В клініко-лабораторній діагностиці
До недавнього часу ферменти були лише об’єктом дослідження в клінічній біохімії, і лише порівняно недавно вони стали використовуватися як аналітичні реагенти, тобто як реактиви для кількісного визначення інших речовин. Переваги ферментативних методів дослідження: висока точність, специфічність, чутливість. До цього слід додати простоту проведення аналізу, значне скорочення часу дослідження і часто відсутність необхідності побудови калібрувальних графіків. Використання ферментів як аналітичних реагентів почалося із так званого оптичного тесту Варбурга. Цей тест ґрунтується на тому, що відновлені форми нікотинамідаденіндинуклеотидів (НАДН+Н+ і НАДФН+Н+) мають виражений максимум поглинання в ультрафіолетовій області при 340 нм, тоді як їх окиснені форми (НАД+ і НАДФ+) цього максимуму не мають. Це дозволяє стежити за ходом ферментативної реакції за збільшенням або зменшенням величини оптичної густини при 340 нм, тобто за збільшенням або зменшенням вмісту НАДН+Н+ (або НАДФН+Н+) в аналізованому зразку. Простим прикладом використання оптичного тесту Варбурга є реакція, що каталізується ЛДГ: піруват + НАДН+Н+ ---> лактат + НАД+ На рис. 3 наведена зміна оптичної густини при довжині хвилі 340 нм у ході цієї реакції. Оскільки в процесі окиснення пірувату кількість НАДН+Н+ знижується, величина оптичної густини також знижується, і це зниження продовжується до того часу, поки весь піруват, що є в пробі, не вступить у реакцію. Цей момент відповідає виходу кривої на графіку на плато. Оскільки піруват і НАДН+Н+ вступають у реакцію в еквімолярних кількостях, то зменшення НАДН+Н+ дорівнює кількості пірувату, що міститься в аналізованому зразку.
Рисунок 3 – Зміна оптичної густини у ході лактатдегідрогеназної реакції
Аналогічним чином може проводитися кількісне визначення всіх речовин, що є субстратами дегідрогеназ (малат, лактат, сукцинат і т. д.). Розглянута вище ЛДГ-реакція може бути індикаторною при визначенні активності АлАТ. У цій спряженій системі реакції відбуваються за схемою АлАТ α-аланін + α-кетоглутарат--------> піруват + α-глутамат, ЛДГ піруват + НАДН+Н+ ---------> лактат + НАД+.
Реакція супроводжується зниженням величини оптичної густини при 340 нм, швидкість якого пропорційна активності АлАТ. Аналогічним чином може бути визначена активність АсАТ, але індикаторним ферментом у цьому випадку буде малатдегідрогеназа.
На використанні глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ) як індикаторного ферменту базується найточніший метод із усіх існуючих методів визначення концентрації глюкози. Тут реакція відбувається за схемою гексокіназа глюкоза + АТФ ---------------> глюкозо-6-фосфат + АДФ Г6ФДГ глюкозо-6-фосфат + НАДФ+ ----------> 6-фосфоглюконат + + НАДФН+Н+. Глюкоза за участі гексокінази фосфорилюється до глюкозо-6-фосфату, який за допомогою Г6ФДГ окиснюється до 6-фосфоглюконової кислоти. Ця реакція супроводжується накопиченням НАДФН+Н+ і, отже, зростанням оптичної густини при 340 нм. Інший підхід до визначення глюкози базується на використанні спряженої системи глюкозооксидаза + + пероксидаза й більш широко відомий. За участі глюкозооксидази глюкоза окиснюється киснем повітря з утворенням перекису водню, кількість якого визначається за його здатністю за наявності пероксидази окиснювати діаміни з утворенням забарвлених продуктів: глюкозооксидаза глюкоза + О2 + Н2О -------------> глюконова кислота + Н2О2, пероксидаза Н2О2 + барвник ---------------> забарвлений продукт + Н2О. Як барвники (індикатори) для пероксидазної реакції запропоновано цілу групу речовин: о-толуїдин, о-діанізидин, фенол+4-аміно-антипірин та ін. Вважають, що реакція з 4-аміно-антипірином має перевагу, оскільки забарвлення, що розвивається, більш стабільне, ніж при використанні інших речовин. Ця сама пероксидазна реакція за участі 4-аміно-антипірину, запропонована Тріндером, може бути використана для кількісного визначення холестеролу й тригліцеридів. При визначенні холестеролу його ефіри гідролізуются холестеролестеразою до вільних жирних кислот і холестеролу, який під впливом холестеролоксидази окиснюється киснем повітря до ∆4-холестенону. Перекис водню, що утворюється при цьому, за наявності пероксидази окиснює речовини-індикатори з утворенням забарвлених сполук, інтенсивність забарвлення яких пропорційна вмісту холестеролу в досліджуваному зразку:
холестеролестераза ефіри холестеролу ------------------> холестерол + R-COOH, холестеролоксидаза холестерол + O2 ----------------------> ∆4-холестенон + H2O2, пероксидаза 2H2O2 + 4-аміно-антипірин + фенол -----> забарвлений продукт + 4H2O2.
Описаний метод визначення холестеролу є найточнішим серед існуючих. У реакції Лібермана-Бурхарда, рутинному методі визначення холестеролу, беруть участь й інші стероли, що призводить до завищених результатів. До інших переваг ферментативного методу необхідно віднести відсутність впливу домішок білірубіну й гемоглобіну, необхідності проводити тривалий гідроліз ефірів і екстракцію холестеролу, відсутність агресивних реагентів. Ще складніша ферментна система може бути використана для визначення тригліцеридів. Тригліцериди розщеплюються ліпазою до жирних кислот і гліцеролу, який за участі гліцерокінази й АТФ фосфорилюється з утворенням гліцерол-3-фосфату. Гліцерол-3-фосфат за наявності гліцерофосфатоксидази окиснюється киснем повітря з утворенням фосфодіоксіацетону й перекису водню, який, у свою чергу, окиснює барвник із утворенням забарвленого комплексу, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації тригліцеридів у досліджуваному зразку. ліпаза тригліцерид + 3H2O ---------> гліцерол + 3R-COOH, гліцерокіназа гліцерин + АТФ -----------> гліцерол-3фосфат + АДФ, гліцеролфосфатоксидаза гліцерол-3фосфат + O2 -------> фосфодіоксіацетон + H2O2, пероксидаза H2O2 + 4-аміно-антипірин + 4-хлорфенол -----------> забарвлений комплекс + 2H2O + HCl.
Цей метод визначення тригліцеридів найбільш специфічний, виключно точний і надзвичайно простий у виконанні. На цей час розроблена ціла група ферментативних методів визначення сечової кислоти. Першим етапом цих методів є розщеплення сечової кислоти уриказою до алантоїну, вуглекислоти й перекису водню: уриказа сечова кислота + 2H2O + O2 ------> алантоїн + CO2 + H2O2.
Пероксид водню, що утворився, може бути визначений різними способами: - за реакцією з 4-аміно-антипірином або іншим аналогічним барвником; - перетворенням метанолу за участі каталази у формальдегід, який визначається спеціальними методами; - окисненням перекисом етанолу в ацетатальдегід, який потім відновлюється НАДН (оптичний тест Варбурга). Слід відзначити високу специфічність усіх ферментативних методів визначення сечової кислоти порівняно з рутинними фосфорно-вольфрамовими методами, оскільки, крім сечової кислоти, фосфорно-вольфрамову кислоту відновлюють аскорбінова кислота, тирозин, триптофан, цистин, цистеїн та ін. Ще більшу кількість методів запропоновано для ферментативного визначення сечовини. Першим етапом усіх цих методів є розщеплення сечовини уреазою до аміаку та вуглекислоти: уреаза сечовина + Н2O ----------> 2NН4+ + CО2. Визначення іонів амонію може бути здійснене різними способами: - класичною бертолетовою реакцією; - модифікованою бертолетовою реакцією із саліцилатом натрію; - за допомогою оптичного тесту Варбурга. В останньому випадку індикаторною є реакція глутаматдегідрогеназа NН4+ +α-кетоглутарат + НАДН+Н+ --> глутамат + НАД+ + + 2Н2О.
Усі ці методи високоспецифічні, оскільки для уреази сечовина є єдиним фізіологічним субстратом, але найточнішим є метод із оптичним тестом Варбурга. На сьогодні розробляється новий напрям у використанні ферментів: ферментативні методи визначення електролітів (К+, Nа+, Сl+). Ці методи базуються на здатності електролітів виявляти активуючу дію на активність деяких ферментів.
|
|||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2016-07-14; просмотров: 321; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.191.11.165 (0.01 с.) |