Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Проведение полимеразной цепной реакции
1. В пробирку емкостью 0,5 мл вносят компоненты реакционной смеси в следующем порядке: деионизованная вода - 36 мкл 10х буфер для ПЦР - 5 мкл дНТФ - 1,5 мкл Праймер 1 - 1,0 мкл Праймер 4 - 1,0 мкл Taq ДНК-полимераза - 0,5 мкл РНК (исследуемый образец) - 5 мкл. 2. Встряхивают пробирку, все капли со стенок собирают центрифугированием в течение 5-10 с. На поверхность водной фазы наносят 50 мкл (2 капли) вазелинового масла. 3. Проводят амплификацию. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах: 2 этап: Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК). Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65оС. Время отжига -20-60 сек. 3 этап: Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72оС. Время протекания синтеза - 20-40 сек. Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемыхе праймерами. Праймеры комплиментарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.
Контроли реакции: - К+ (положительный) - контрольная кДНК, входящая в состав тест-системы, - К - (отрицательный) - деионизованная вода. Смеси для контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемого образца. ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент); Праймеры (синтетические олигонкулеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплиментарны последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа; Смесь (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК); Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК); Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента). Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n-число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двуцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Результаты исследования учитывают путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле. 1. Приготовление буфера для электрофореза. Для приготовления 1 л буфера для электрофореза к 100 мл 10-кратного раствора ТBE добавляют 900 мл воды. 2. Приготовление 2 % агарозного геля (в соответствии с инструкцией в наборе).
В 30 мл буфера для электрофореза добавляют 0,6 г агарозы. Нагревают взвесь до растворения агарозы. Охлаждают раствор до 50°С и добавляют бромистый этидий (из водного раствора, содержащего 10 мг/мл и хранящегося при 4°С в светонепроницаемом сосуде) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Охлажденную агарозу заливают в специальную форму и вставляют ‘гребенку”, от зубцов которой в геле останутся лунки для проб. Необходимо, чтобы между дном лунки и основанием геля оставался слой агарозы толщиной 0,5-1,0 мм. После того как гель полностью затвердеет (30-40 мин при комнатной температуре), осторожно удаляют ‘гребенку”. Помещают гель в аппарат для горизонтального электрофреза ("Диа-М''). Добавляют достаточное количество буфера для электрофореза, так чтобы гель был закрыт слоем буфера толщиной 1 мм. 3. Электрофорез продуктов амплификации. Из пробирок с исследуемыми образцами после завершения амплификации отбирают по 3 мкл реакционной смеси, добавляют 2 мкл красителя (0,25% раствор бромфенолового синего. 0,25% ксиленцианола в формамиде), перемешивают наконечником для пипеточных дозаторов и вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки. Электрофорез проводят при напряженнии 15 В/см длины геля в течении 30 минут. 4. Учет результатов. Обычно бромистый этидий (0,5 мкг/мл) добавляют в гель. В его присутствии электрофоретическая подвижность линейной двухцепочечной ДНК снижается примерно на 15%, но при этом появляется возможность наблюдать за процессом разделения непосредственно под источником УФ - излучения во время или в конце разделения. Можно также проводить электрофорез в отсутствии бромистого этидия и окрашивать ДНК уже после завершения разделения. В этом случае гель помещают в электрофорезный буфер или воду, содержащие бромистый этидий, на 45 мин при комнатной температуре. Предостережение. Бромистый этидий - сильный мутаген. Все манипуляции с гелями и растворами, содержащими краситель, необходимо проводить в перчатках. Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе "Трансиллюминатор". Результаты реакции выявляют в виде светящихся красноватых полос. Положительными считаются пробы, в которых полосы в геле располагаются точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля. В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких полос, или они не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе. Преимущества:
|
||||||
Последнее изменение этой страницы: 2022-09-03; просмотров: 45; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.133.112.203 (0.007 с.) |