Выделение ДНК, её синтез и рестрикция

 

ДНК может быть изолирована или выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра.

 

Этапы выделения ДНК:

 

1. быстрый лизис клеток

2. удаление с помощью центрифугирования клеточных органелл и мембран

3. ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа

4. концентрирование молекул ДНК путём преципитации в этаноле

 

Из 1 грамма ткани или 10⁹ клеток → 2 мг ДНК.

У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов или лимфоцитов. Для этого собирают 5 – 20 мл венозной крови, затем выделяют клетки специальным методом и разрушают клетки и ядерные мембраны, добавляя буферные растворы, которые содержат денатурирующие агенты. После разрушение мембран клеток добавляют протеиназу К/Е, затем проводят фенол – хлороформную экстракцию для разрушения белков, затем ДНК осаждают в этаноле (75^о), высушивают ДНК в течение суток и растворяют в специальном буферном растворе и в дистиллированной воде.

Оценку качества полученной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности в области белкового и нуклеинового спектра поглощения. В чистых образцах соотношении Е (260) / Е (280) > 1,8.

В противном случае процедуру очистки следует повторить, т.к. белки должны быть удалены. В процессе сложного и многообразного функционирования участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные, регулируемые и обратимые изменения. Эти модификации осуществляются с помощью ферментов (ДНК – полимераза, рестриктаза).

Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК – полимеразы. И в бактериальных клетках и клетках эукариот содержатся 3 различные формы ДНК – полимераз. Все они обладают синтезирующей активностью и способны удлинять цепь ДНК в направлении 5^/ - 3^/, последовательно присоединяя по 1 нуклеотиду к 3^/ - ОН концу, причем точность синтеза определяется комплементарностью. Т.о. для работы фермента ДНК – полимераза необходима однонитевая матричная ДНК с 3^/ - концом. Кроме того в середине ДНК должны присутствовать 4 типа dNTP (дезоксинуклеотид-3-фосфаты), сахар и 3 остатка фосфорной кислоты.

В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК – полимераза α, которая обладает различной активностью, в том числе и экзонуклеазной активностью в направлении 3^{/ -} 5^/. Это позволяет исправлять (репарировать те дефекты, которые были допущены при подборе комплементарных оснований). Экзонуклеазная активность используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов – НИК – трансляция.

Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью – рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), значительно расширились возможности генной инженерии.

In vivo рестриктазы участвуют в системе распознавания и защиты своих и чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4 – 6, реже 8 – 12 нуклеотидов в 2-цепочечной молекуле ДНК и разрезают ДНК на фрагменты в местах локализации этих последовательностей (в сайтах рестрикции).

Количество образующихся рестрикционных молекул ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов – характером распределения сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции.

В настоящее время известно более 500 типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферментов узнает свою специфическую последовательность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных типов бактерий и обозначают первыми 3 латинскими буквами видов бактерий.

В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают 3 класса рестриктаз:

· часто шипящие

· средне шипящие

· редко шипящие

 

Рестриктазы, узнающие длинные специфические последовательности (8 - 12 п.о.) являются редко шипящими, а узнающие короткие (4 – 5 п.о.) – часто шипящие.