![]() Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву ![]() Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Бактериологический диагноз сальмонеллеза
· Исследование испражнений и крови больного. Окончание исследования. · Учет результатов роста культур в средах минимального дифференцирующего ряда, на скошенном МПА. · Учет пробы с сальмонеллезным бактериофагом. · Серологическая идентификация выделенной культуры по схеме Кауфмана-Уайта. · Учет чувствительности выделенной культуры к антибиотикам. · Заключение, выдача результата исследования испражнений больного. · Заполнение паспорта на выделенные культуры.
Занятие 17 (демонстрационное). Определение генотипа, ассоциированного с патогенностью salmonella sp., методом полимеразной цепной реакции В качестве одной из стабильных и перспективных мишеней в ДНК сальмонелл при использовании молекулярно-диагностических методов экспресс-диагностики (ПЦР и ДНК-зондирование) и анализа потенциальной патогенности штаммов выбран и используется фрагмент гена инвазивности inv, расположенный в пределах «острова патогенности» SP-I на хромосоме бактерий Salmonellae sp. Наличие данного гена (или всего «острова патогенности») у тестируемого штамма свидетельствует о наличии у него инвазивных свойств и потенциальной патогенности. · Приготовление суспензии 107 КОЕ/мл в дистиллированной Н2О из «чистой» культуры анализируемых штаммов сальмонелл. · Проведение термоинактивации и экстракции тотальной ДНК сальмонелл путем прогревания суспензии микробов при 100 оС в течение 15 мин. · Приготовление 1,4 % агарозного геля и трис-боратного буфера для гель-электрофореза. · Осуществление программирования амплификатора «Терцик» для ПЦР-детекции гена инвазивности (inv) сальмонелл. · Подготовка реакционной смеси для постановки ПЦР и осуществление амплификации проб на термоциклере. · Выполнение гель-электрофореза ампликонов и учет результатов ПЦР. · Предварительное заключение о патогенности изучаемой культуры. ПЦР проводят только в одноразовых микропробирках с использованием одноразовых наконечников для внесения всех компонентов амплификационной смеси. Устанавливают в штатив и маркируют пробирки для амплификации по числу исследуемых проб и две дополнительные пробирки (положительный и отрицательный контроли). На одну пробу объемом 25 мкл готовят амплификационную смесь следующего состава:
1. 2 мкл 10х ПЦР-буфера; 2. 1 мкл 2,5 мМ раствора дНТФ; 3. 1 мкл БСА; 4. Дистиллированная вода до - 20 мкл; 5. 5-10 пкм каждого праймера (по 1 мкл); 6. 0,2 мкл Таq-ДНК-полимеразы. Приготавливают общую амплификационную смесь на все число проб и две пробы (положительный и отрицательный контроли). Перемешивают полученную смесь пипетированием и вносят в амплификационные пробирки по 20 мкл в каждую. Исследуемые образцы тотальной ДНК сальмонелл в количестве 5 мкл вносят в амплификационные смеси с помощью отдельных наконечников для каждого образца, после чего смесь перемешивают пипетированием и наслаивают 40-50 мкл вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл). В качестве положительного контроля применяют 2 мкл образца ДНК, экстрагированной методом кипячения из суспензии клеток штаммов S. typhimurium 4244или другого вирулентного тест-штамма сальмонелл, с концентрацией 1·107 КОЕ. В качестве отрицательного контроля используют 5 мкл дистиллированной воды. Пробирки закрывают и помещают в амплификатор со следующей температурно-временной программой: «горячий» старт – 94 °С - 3 мин, затем 35 циклов: денатурация при температуре 94 °С - 1 мин, «отжиг» 50 °С - 1 мин, элонгация цепи при 72 °С - 1 мин; завершающий этап при 72 °С - 5 мин. После амплификации препараты смешать с 3 мкл лидирующего красителя - бромфенолового синего. Для проведения электрофореза используется заранее приготовленный 1,4% агарозный гель. Гель-электрофорез проводится в трис-боратной буферной системе в течение 30 мин при напряжении 10 v/см. Визуализацию продуктов ПЦР осуществляют окрашиванием геля в течение 10 мин бромистым этидием в кoнцентрации 0,5 мкг/мл и видеорегистрацией результатов электрофореза цифровой камерой при помощи УФ-трансиллю-минатора с длиной волны 260-300 нм. В положительных образцах должна наблюдаться интенсивно окрашенная полоса ампликонов ДНК, соответствующая размеру 240 п.н.
6.5. Приложение
|
|||||
Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; просмотров: 394; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.16.218.105 (0.004 с.) |