Тема: вирусы. Особенности строения и жизнедеятельности. Взаимодействие вируса и клетки. Культивирование вирусов.

 

Цель занятия: познакомиться с организацией и оборудованием вирусологической лаборатории, изучить природу и происхождение вирусов, их отличия от бактерий, освоить методы культивирования вирусов и методы обнаружения вирусов в культуре клеток.

План занятия.

1. Организация и оборудование вирусологической лаборатории.

2. Общая характеристика вирусов, их место в биосфере.

3. Основные критерии современной классификации вирусов.

4. Структурные компоненты вириона.

5. Химический состав вирусов.

6. Репродукция вирусов. Стадии взаимодействия вируса с клеткой хозяина.

7. Методы культивирования вирусов: а) в организме восприимчивого животного; б) в курином эмбрионе; в) в культуре клеток (тканевые культуры).

8. Характеристика и классификация тканевых культур.

9. Методы обнаружения вируса в культуре клеток: а) цитопатический эффект; б) цветная проба; в) метод бляшек; реакция гемадсорбции; г) реакция гемагглютинации (РГА).

 

Задания для выполнения лабораторной работы.

 

1. Провести заражение куриных эмбрионов вируссодержащим исследуемым материалом.

Подготовка яиц. На скорлупе яиц с живыми эмбрионами, которые различают по красному цвету кровеносных сосудов и движению эмбриона (при овоскопии), карандашом отмечают место заражения. Скорлупу перед заражением обрабатывают 70% спиртом, обжигают на пламени, а затем дезинфицируют 2% раствором йода.

Существуют следующие способы заражения: в аллантоисную полость, в полость амниона, в желточный мешок.

Заражение в аллантоисную полость. Специальным стилетом прокалывают скорлупу сбоку и над воздушной камерой, после чего шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Оба прокола в скорлупу заливают расплавленным стерильным парафином. В зависимости от типа вируса инкубируют 48-72 ч.

Заражение в полость амниона. Скорлупу над воздушной камерой разрезают ножницами и через образовавшееся окно радиусом 1-1,5 см осторожно отслаивают глазным пинцетом подскорлупную оболочку. Через обнажившийся участок хорион-аллантоисной оболочки делают прокол глазным пинцетом и продвигают его к эмбриону. Затем пинцетом захватывают амниотическую оболочку и осторожно вытягивают часть наружу через образовавшееся отверстие в хорион-аллантоисной оболочке. Извлеченный эмбрион перехватывают широким пинцетом, который держат в левой руке. Затем шприцем с иглой вводят в вытянутый амниотический мешок 0,1-0,2 мл исследуемого материала. После заражения пинцет разжимают и амнион погружается в аллантоисную полость. Окно в скорлупе закрывают стеклянным колпачком, края которого заливают стериальным парафином. Яйцо помещают в штатив тупым концом вверх.

Заражение в желточный мешок. Скорлупу прокалывают по центру воздушной камеры и через образовавшееся отверстие при помощи туберкулинового шприца с иглой № 21 длиной 3,8 см вводят 0,2-0,5 мл испытуемого материала в желточный мешок. Для этого иглу вводят вертикально до упора. Затем ее быстро вынимают и отверстие заливают парафином. Яйца в вертикальном положении инкубируют 48 ч при 37˚С.

2. Изучить цитопатическое действие (ЦПД) вируса на клеточные культуры по демонстрационным микропрепаратам, таблицам.

3. Провести реакцию гемагглютинации (РГА) и учесть результат.

Реакция гемагглютинации (РГА) широко применяется в вирусологии для обнаружения вирусов и их титра в исследуемом материале. РГА осуществляется на плексигласовых пластинах с лунками, в которых готовят двукратные разведения вируссодержащего материала. Затем добавляют взвесь эритроцитов и инкубируют 30 мин при комнатной температуре.

 

Таблица 13

Схема постановки РГА

Ингредиенты, мл	Номер лунки, разведения
	1	2	3	4	5	6
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	контроль
Физиологический раствор	-  0,5	0,5 0,5	0,5 0,5	0,5 0,5	0,5 0,5	0,5 0,5 вылить в дез. р-р
Вируссодержащий материал
1% взвесь эритроцитов	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Инкубация 30 мин при комнатной температуре
Результат

При геммагглютинации осадок имеет форму зонтика и занимает все дно лунки. При отсутствии феномена эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска.

 

Вопросы для обсуждения.

1. Правила и режим работы в вирусологических лабораториях.                    2. Оборудование вирусологической лаборатории. 3. Природа и происхождение вирусов. 4. Отличие вирусов от бактерий.                           5. Классификация вирусов по характеру нуклеиновой кислоты и особенности морфологии.       6. Классификация вирусов по тропизму к тканям макроорганизма и кругу поражаемых хозяев. 7. Структура и функции капсида, капсомеров, нуклеокапсида, суперкапсида.                      8. Химический состав вирусов. 9. Роль нуклеиновых кислот, белков, липидов, углеводов. 10. Адсорбция вируса на клетке хозяина, проникновение в клетку, раздевание, депротеинизация, транскрипция вирусного генома, трансляция вирусных и-РНК, репликация вирусной нуклеиновой кислоты, синтез вирусных белков, сборка вирусной частицы, выход из клетки. 11. Методы культивирования вирусов.                       12. Характеристика и классификация тканевых культур. 13. Методы обнаружения вируса в культуре клеток.

 

Дополнительный материал.

Таблица 14

Классификация вирусов позвоночных

Семейство вирусов	Представители семейства
ДНК-содержащие вирусы
Poxviridae	Вирус натуральной оспы, осповакцины
Herpesviridae	Вирус простого герпеса 1-2 типа, опоясывающего герпеса и ветряной оспы, цитомегалии человека и др.
Papovaviridae	Вирус папилломы, бородавок человека, полиомы и др. Аденоассоциированные вирусы и др.
Adenoviridae	Аденовирус человека и др.
Parvoviridae	Парвовирус человека и др.
Hepadnoviridae	Вирус гепатита В
РНК-содержащие вирусы
Orthomyxoviridae	Вирус гриппа человека и животных
Paramixoviridae	Вирусы парагриппа, кори, эпидемического паротита, респираторно-синцитиальный вирус
Rhabdoviridae	Вирус бешенства, везикулярного стоматита
Togaviridae	Вирусы клещевого энцефалита, краснухи
Picornaviridae	Энтеровирусы (вирус полиомиелита, Коксаки, ЕНСО), риновирусы
Retroviridae	Вирус саркомы Рауса, висны, СПИДа

 

Культуры клеток в вирусологии

 

       Для культивирования вирусов в вирусологической практике используется культура клеток. Клетки по числу жизнеспособных генераций можно подразделить на 3 типа: первичные, перевиваемые и полуперевиваемые.

       К первичным относятся культуры клеток, способные выдерживать не более 5-10 пассажей. Их готовят преимущественно из эмбриональных тканей. 

       Перевиваемые культуры получают из опухолевых клеток одного типа, хорошо размножающегося «in vitro» в течение неопределенного срока (HeLa, Hep-2, KB).

       Полуперевиваемые относятся культуры диплоидных клеток, полученных из фибробластов человеческого эмбриона. Эти клетки выдерживают до 100 генераций, сохраняя исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки человека нашли широкое применение в вирусологии, особенно в производстве вакцин.

 

Рис. 18. Схема взаимодействия вируса с клеткой человека (репродукция, сборка и выход вириона).

 

 

                                          

 

 

Оформление лабораторной тетради.

 

Записать схему постановки РГА и цветной пробы; записать классификацию вирусов, типов тканевых культур; зарисовать демонстрационные препараты (ЦПД, вирусные включения, гемадсорбция).

 

ЗАНЯТИЕ № 17