Выделение днк из периферической крови

Кровь собирали в пластиковые пробирки с антикоагулянтом 0,1 М раствора EDTA-К3 (pH 7,3) в соотношении кровь/антикоагулянт 1/100.

Забор крови проводили также в виварии КГМУ. В латеральную хвостовую вену или в вентральную/дорсальную артерию устанавливались иглы шприца, для забора крови. Для улучшения кровообращения и быстрому выделения образцов крови хвост прогревался в теплой воде.

Образцы крови выделялись для определения изменения длины тeлoмер, и для анализирования уровня гормонов стресса (кортизола, адреналина), а также ЛДГ, пролактина, глюкозы и тестостерона. Выделение ДНК производили при помощи набора компании Синтол (Россия), согласно приложенному протоколу выделения. В пробирки вносили по 100мкл цельной периферической крови испытуемых. Затем во все пробирки вносили по 10мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) и 300мкл лизирующего раствора. Перемешивали содержимое на вортексе Personal spinvortex microspin FV-2400 компании Biosan (Латвия). Смесь инкубировали при температуре 65 °С в течении 15 мин., периодически перемешивая содержимое пробирок. Если кровь содержала сгустки увеличивали время лизиза до 30 мин. Центрифугировали содержимое пробирок в течении 5 мин 12 тыс об/мин.. В дальнейшем использовали надосадочную жидкость, для этого перенесли ее в новую пробирку. Добавляли 200мкл осаждающего раствора.

Перемешивали содержимое пробирок на вортексе, после чего оставляли на 2 мин., потом снова перемешивали и оставляли на 5 мин. Центрифугировали при помощи центрифуги для микропробирок MiniSpin компании Eppendorf (Германия) 30 сек. при 5000 об/мин. Удаляли жидкость из коллектора колонки при помощи микропипетки. Затем наносили на колонку 300мкл промывочного раствора №1. Все содержимое перемешивали на вортексе, а после также центрифугировали 30 сек при 5000 об/мин. Опять удаляли надосадочную жидкость и наносили 500мкл промывочного раствора №2. Перемешали содержимое пробирок на вортексе, после чего снова центрифугировали 30 сек при 10000 об/мин. Снова удаляли жидкость и наносили 500мкл промывочного раствора №2. Перемешали содержимое пробирок на вортексе, после чего снова центрифугировали 30 сек при 10000 об/мин. Аккуратно переносили пробирки в термостат, оставили с открытыми крышками на 5-10 мин., при температуре 65 °С. Прогревали элюирующий раствор до 70 °С и добавляли в пробирки по 50мкл.

Снова перемешали содержимое в вортексе, после смесь отправили инкубироваться при темпертуре 65 °С в течении 5 мин., центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин. ДНК хранили при -20 °С

 

2.2.6. Определение уровня гормона кортизола в крови.

 

 

Методы поиска литературы:

В электронных базах данных PubMed, Киберленинка, и поисковых сайтах Google и Яндекс проводились поиски оригинальных исследований и обзоров литературы, написанных на английском и русском языках и содержащих ключевые слова: длина теломер или тeлoмеры и стресс, психологический стресс, физические упражнения или физическая активность, адреналин, глюкоза, ЛДГ, пролактин, тестостерон, креатинкиназа. Ручной поиск соответствующих статей также проводился с использованием цитируемых ссылок из опубликованных оригинальных исследований и обзоров литературы. Метод измерения длин тeлoмер и основные результаты определения длины тeлoмер были взяты из оригинальных исследований.

 

Статистический анализ

Все статистические анализы проводились с помощью программного обеспечения SigmaStat v3.1 (Jandel Scientific). Все данные представлены в виде средних значений ± Стандартная ошибка среднего (S. E. M.). Анализ поведенческих данных проводился с помощью двустороннего метода ANOVA. Статистическое сравнение концентрации кортизола в стволе ствола между стилями совладания и группами лечения проводилось с помощью двустороннего метода ANOVA. Двусторонняя ANOVA также использовалась для определения значимых различий в относительных уровнях экспрессии мРНК генов-кандидатов между стилями совладания и группами лечения. Если это существенно (P Графики были сгенерированы с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (США).

 

Этическое заявление

Эксперименты были одобрены ведомственным Комитетом по уходу за животными в соответствии с принципом 3Rs, и они были реализованы в соответствии с законодательством по уходу и использованию экспериментальных животных.

 

Cell Metab 2012 Mar 7;15(3):405-11. doi: 10.1016/j.cmet.2012.01.001.