![]() Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву ![]() Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Технологическая цепочка - Последовательность действий ПЦР
1. Денатурация 95 о С – обратимая денатурация - расплетание двухнитевой ДНК и превращение в однонитевую путем разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований противоположных цепей ДНК под воздействием высоких температур. 2.Отжиг 62-65 о С – это присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент ДНК и были 3. Элонгация (синтез) 72 о С. После отжига праймеров Taq-полимераза начиначинает достраивание второй цепи ДНК с 3'-конца праймера с использованием дНТФ. Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается. Эффект плато Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает – проявляется эффект плато. Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3–1 пмоль. КРИТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПЦР Температурный режим Преактивация: Выдерживание реакционной смеси перед началом ПЦР в течении 0,5-10 минут при 92оС позволяет инактивировать примесные белки и способствует более полной денатурации матричной ДНК Выдерживание реакционной смеси в течении 5-10 минут при температуре 72оС для полного завершения синтеза продуктов ПЦР Количество циклов Факторы уменьшающие скорость роста количества продукта ПЦР: o Истощение субстрата (дНТФ или праймеров) o Ингибирование ПЦР конечными продуктами реакции o Конкуренция за субстрат со стороны неспецифичных продуктов реакции o Неполная денатурации дцДНК o Стабильность компонентов реакции
o «Изнашивание» ДНК-полимераз o Увеличение вязкости реакционной смеси (препятствует элонгации праймеров) Ионы двухвалентных металлов Объем реакционной смеси Матричные нуклеиновые кислоты ПОЧЕМУ ЭТО ВАЖНО? Неверный подбор условий и компонентов ПЦР приводит к образованию побочных продуктов реакции, «шмира», димеров праймеров, низкому выходу или полному отсутвию продуктов реакции. ШМИР:
ЕСЛИ ВСЕ ПРАВИЛЬНО
ПЦР с обратной транскрипцией - история открытия и термины Обратная транскрипция — это процесс образования двуцепочечной ДНК на основании информации в одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно транскрипции, направлении. Идея обратной транскрипции вначале была очень непопулярна, так как противоречила центральной догме молекулярной биологии, которая предполагала, что ДНК транскрибируется в РНК и далее транслируется в белки. Однако в 1970 году Хауард Мартин Темин и Дейвид Балтимор, американские ученые, независимо друг от друга открыли фермент, названный обратной транскриптазой (ревертазой), и возможность обратной транскрипции была окончательно подтверждена. В 1975 году Темину и Балтимору была присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины. Обратная транскрипция является необходимым этапом жизненного цикла РНК-вирусов. Она позволяет перевести РНК-геном вируса в ДНК, с которой уже можно производить транскрипцию вирусных мРНК и новых геномных РНК. Ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза — фермент (КФ 2.7.7.49), катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе, называемом обратной транскрипцией. Обладает активностью РНКазы Н (т.е. разрушает цепь РНК, входящую в состав ДНК/РНК-дуплекса). Подобно всем ДНК-полимеразам функционирует только при наличии затравки (праймера). Денатурация или плавление - расхождение цепей ДНК при нагревании ДНК или при повышении pH. Расхождение цепей происходит из-за разрушения слабых водородных связей и плоскостных взаимодействий между основаниями.
Денатурация – процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатурацией, реассоциацией или отжигом, происходит при понижении температуры или рН. • При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение комплементарных цепей затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей. • При ренатурации сначала соединяются участки цепей с повторенной ДНК и затем с уникальными участками • Если совместно отжигают одноцепочечные ДНК, происходящие из различных источников, то формирование двухцепочечной структуры ДНК называют гибридизацией.
|
||||||
Последнее изменение этой страницы: 2021-05-27; просмотров: 175; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.142.119.111 (0.009 с.) |