Этапы выделения чистой культуры анаэробных бактерий

Выделение чистых культур анаэробов изучаем на примере выделения C.perfringensиз раневого отделяемого при подозрении на газовую гангрену.

1-й этап. Обогащение на среде Китта–Тароци.

1.Приготовление мазков из раневого отделяемого и окраска по Граму. Под микроскопом видны крупные грамположительные палочки, часть которых окружены неокрасившейся капсулой (в виде белого ободка), что позволяет заподозрить газовую инфекцию.

2.Посев раневого отделяемого на среду Китта-Тароцци, предварительно прокипяченной в течении 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются;

3.Инкубация посевов в термостате при 37⁰ в течение 18-24 часов.

2-й этап. Получение изолированных колоний.

1.Изучение характера роста на среде Китта-Тароцци. При росте C.perfringens  она мутнеет и в ней образуется газ (результат образования газа при ферментации глюкозы).

2.Приготовление мазка из бульонной культуры и окраска по Граму. Под микроскопом видны крупные грамположительные палочки.

3.Получение изолированных колоний анаэробов двумя способами:

- на поверхности твердой питательной среды (сахарно-кровяного агара) по Цейсслеру в анаэробных условиях;

- в глубине среды Вильсон-Блера по Вейнбергу.

4.Инкубация посевов в термостате при 37⁰ в течение 18-24 часов.

3-й этап. Выделение чистой культуры.

1.Макроскопическое изучение выросших колоний анаэробов:

а) на сахарно-кровяном агаре, обратить внимание на зону гемолиза вокруг колоний, что является признаком гемолитической активности бактерий (вирулентности);

б) в глубине среды Вильсон-Блера, обратить внимание на цвет колоний. Черные колонии образует C.perfringensза счет образования сульфата железа (FeS).

2.Приготовление из подозрительных колоний мазков и окрашивание их по Граму. Под микроскопом выявляются крупные грамположительные палочки;

3.Остаток колонии, подвергшейся микроскопическому изучению, отсевают на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры.

4.Инкубация посевов в термостате при 37⁰ в течение 18-24 часов.

4-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры анаэробов.

1.Макроскопическое определение роста культуры на среде Китта-Тароцци;

2. Проверка выделенной культуры на чистоту - приготовление мазков со среды Китта-Тароцци и окрашивание их по Грамму. Во всех полях зрения чистая культура должна быть однородной морфологически и тинкториально.

3.Окончательная идентификация выделенной чистой культуры анаэробов

проводится по токсигенности в реакции нейтрализации экзотоксина на белых мышах, биохимическим, антигенным свойствам и по генетической структуре.

5-й этап. Учет результатов идентификации и оформление заключения о виде.

Например, выделена чистая культура C.perfringens, идентификация проведена по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, токсигенным свойствам и по генетической структуре. 

 

Вирусологические методы

 

Для выделения и культивирования облигатных паразитов (вирусов, риккетсий и хламидий) применяются вирусологические методы: заражение тканевых культур, куриного эмбриона и восприимчивых лабораторных животных. Вирусологическое исследование проводится в два этапа: выделение вируса и идентификация вируса. Материалами для вирусологического исследования могут быть отделяемое носоглотки, испражнения, кровь и другие материалы в зависимости от локализации вируса. Вирусологические методы также применяются для культивирования некоторых факультативных паразитов, например, микоплазмы, бруцелл, франциселл, легионелл и др.

Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость с целью

выделения чистой культуры вируса гриппа и идентификации.

1-й этап. Выделение вируса (культивирование вируса).

Для заражения используют куриные эмбрионы 8-14 дневного возраста.

Ход работы:

1) перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушной камеры;  

2) яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху;

3)стерилизация скорлупы на тупом конце яйца в такой последовательности: спиртом, 2 % йодной настойкой ещё раз спиртом и обжиганием;

4) над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы;

5) Пастеровской пипеткой вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры;

6) отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем;

7) инкубация эмбриоа в термостате в течение 2-3 суток при 37⁰ С.

2-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры вируса.

Ход работы:

1) яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушное пространство было наверху;

2) обработка скорлупы последовательно спиртом, йодом, опять спиртом и обжиганием;

3) осторожно снимают лейкопластырь, рассекают и сбрасывают скорлупу, определяют гибель эмбриона, отсасывают аллантоисную жидкость и разливают в пробирки;

4) идентификация вируса проводится по гемагглютинирующей активности (по способности склеивать куриных эритроцитов) в реакции гемагглютинации. 

 

Реакция гемагглютинации (РГА)

Применяется для идентификация вирусов по гемагглютинирующей активности. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами (имеющие гемагглютинин – гликопротеид суперкапсида), способны гемагглютинировать эритроцитов различных животных. Например, вирусы гриппа – куриных эритроцитов.

Компоненты реакции:

1) исследуемый материал – аллантоисная жидкость(гемагглютинин вируса гриппа?);

2) 5% суспензия куриных эритроцитов;

3) физиологический раствор.

Существует два способа постановки реакции: капельный способ на стекле и объемный способ в пробирке.

Капельный способ на стекле: 

Опыт:1 капля аллантоисной жидкости + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов.

Контроль: 1 капля физ. раствора + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов. Хорошо перемешать сначала контрольную каплю, затем- опытную.

Наличие гемагглютинации (выпадение хлопьев красного цвет) в опыте при ее отсутствии в контроле (гомогенное покраснение) указывает на содержание вируса гриппа в исследуемом материале. Гемагглютинация – это склеивание эритроцитов под влиянием гемагглютинина вируса. Вид вируса гриппа (А,В,С) дифференцируют по антигенной структуре с помощью РСК, ИФА, а серотип – РТГА (практические навыки 9.7). Окончательную идентификацию также можно провести по генетической структуре (ПЦР).