Тромбин: структурно-функциональные особенности.

Тромбин-протеолитический фермент, относится, как и все ферменты свертывающей системы крови (кроме фактора XIIIa), к группе пептид-гидролаз, подгруппе протеиназ, классу сериновых протеиназ семейства трипсина.

Тромбин – гликопротеид (37 kDa), содержащий около 5% углеводов. Молекула тромбина состоит из двух полипептидных цепей (А и Б), соединенных дисульфидной связью (Рис 22). Выявлена высокая степень гомологии аминокислотной последовательности тромбина и родственных протиназ – трипсина и химотрипсина в каталитическом участке активного центра.

Тромбин и трипсин имеют одинаковую первичную специфичность: они расщепляют эфирные, амидные и пептидные связи основных аминокислот– аргинина и лизина. Но тромбину, в отличие от трипсина, свойственна избирательность при отборе субстратов и расщепляемых связей. Он не гидролизует обычные субстраты протеиназ такие, как казеин, гемоглобин, альбумин, а проявляет специфичность высшего порядка в выборе субстратов и гидролизуемых связей.

В отличие от трипсина тромбин-узкоспецифичная протеиназа, тк расщепляет только одну или несколько связей в своих специфических субстратах (факторах V и VIII, фибриногене и др) и рецепторах, активируемых протеиназами (PAR-1и PAR-4).

Высокая специфичность тромбина в отношении определенных субстратов и рецепторов клеток обеспечивается определенными участками в структуре тромбина, так называемыми экзосайтами, экспонированными на поверхности молекулы: анионсвязывающим экзосайтом 1(АВЕ1) (называемым также центром узнавания субстратов и рецепторов) и экзосайтом 2 (Рис 22). Экзосайты локализованы вне активного центра на поверхности молекулы. Анионсвязывающий экзосайт 1 отвечает за взаимодействие тромбина с комплементарными участками рецепторов клеток (тромбомодулином эндотелия, PAR,) и специфических субстратов (фибриногена, факторов VIII,V, кофактора II гепарина). Анионсвязывающий экзосайт 2 обеспечивает связывание тромбина с гепарином, ГПIba тромбоцитов. В области анионсвязывающего экзосайта 1 происходит взаимодействие тромбина с его высокоспецифическим экзогенным ингибитором - гирудином. Гирудин (7kDa)– полипептид из секрета слюнных желез медицинской пиявки (Hirudo medicinalis), который в пикомолярной концентрации блокирует протеолитическую активность фермента с константой ингибирования Ki равной 10^-13 .

Для расщепления тромбином менее специфических субстратов, таких как протеин С, TAFI (ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином), факторы свертывания крови XI и XIII (фибринстабилизирующий фактор) необходимо предварительное связывание тромбина через экзосайты молекулы с кофакторами, каковыми могут быть специфические рецепторы или субстраты. Предварительное специфическое взаимодействие тромбина с кофакторами вызывает аллостерические конформационные изменения молекулы фермента, облегчающее расщепление не специфических субстратов тромбина.

C помощью рентгеноструктурного анализа и сайт-направленного мутагенеза выявлены конформационные изменения, происходящие в молекуле тромбина при связывании иона Na, которые приводят к повышению скорости расщепления фибриногена и других прокоагулянтных специфических субстратов и рецепторов (Рис 22,23). Структурный переход молекулы тромбина при связывании Nа⁺ вызывает аллостерическое конформационное изменение молекулы от «медленной» (свободной от Na⁺) формы к «быстрой» (cвязанной с Na⁺). При физиологических условиях (145 мМ NaCl) существуют обе формы. Быстрая форма тромбина связывает фибриноген с более высоким сродством и гидролизует его с более высокой скоростью (kcat/Km), чем медленная. В то же время медленная форма тромбина более специфично активирует антикоагулянт - протеин С.

Таким образом, аллостерические изменения конформации молекулы тромбина могут определять его прокоагулянтные или антикоагулянтные функции.

Высокая специфичность тромбина впервые продемонстрирована на примере его основного субстрата фибриногена, у которого тромбин гидролизует только четыре аргинил(Арг)-глициновые(Гли) связи из 387 доступных трипсину. Катализ образования фибриновых сгустков -наиболее известная и лучше других изученная биологическая функция тромбина.