Система быстрой аппликации веществ

Быстрые концентрационные изменения концентрации агониста на внешней стороне пейча производились с помощью так называемой “пипетки быстрой аппликации” (Colquhoun et al. 1992). Эта пипетка изготавливалась из Θ-капилляров, содержащих внутреннюю перегородку. Внешний диаметр был 1,5 мм; толщина стенок

 

Рис. 2.6 Схема регистрации токов с outside-out пейча с использованием системы быстрой аппликации

а, Экспериментальная последовательность получения токов с outside-out пейча при быстрой аппликации агониста (1 мс). Сначала клетка идентифицировалась по морфологическим признакам, и пейч-кламповский электрод позиционировался над ней (а₁). Затем между электродом и клеткой образовывался контакт с высоким сопротивлением (гигасил), после чего мембрана под электродом прорывалась – whole cell mode (а₂). После этого электрод отрывался от клетки с участком мембраны, который образовывал outside-out пейч. Этот пейч устанавливался в поток раствора (контрольного/отмывающего), исходящий их одной камеры двухкамерной пипетки (а₃). В другой камере находился раствор агониста (ГАМК, 1 мМ). Эта пипетка была смонтирована на двух пьезокристаллах, меняющих изгиб в зависимости от подаваемого на них тока. При подаче короткого импульса пипетка смещалась, направляя раствор агониста на пейч, затем возвращалась обратно. б, Фотография двухкамерной пипетки с размещенном в потоке раствора электродом с outside-out пейчем под микроскопом (калибровка – 40 мс). Для дополнительного контроля всех стадий приготовления outside-out пейча использовался мониторинг тока, регистрируемого в режиме фиксации потенциала в ответ на 20 мс сдвиг потенциала на -5 мВ. Стадиям а₁, а₂ и а₃ соответствуют изменения формы тока в₁, в₂ и в₃.

0,2 мм; внутренней перегородки 0,15 мм. Пипетки вытягивались на программируемом вытягивающем устройстве фирмы Sutter Instruments (USA) модель P-87. Диаметр кончика был 230-250 μм. С обратной стороны в отсеки капилляра вводились тонкие нейлоновые трубочки, которые присоединялись к гравитационной системе подачи растворов. Пипетка приклеивалась к пластинке, состоящей из двух пьезокристаллов, которые при подачи на них электрического тока изгибались. Таким образом, достигалась возможность смещать кончик пипетки в пространстве очень быстро и на различные интервалы времени. В один отсек пипетки подавался контрольный раствор, в другой раствор агониста (Рис. 2.6).

Outside-out пейч, полученный с нейрона, вводился в контрольный раствор рядом с границей раствора, содержащего агонист. Пьезокристалл, перемещающий двухканальную пипетку, присоединялся к стандартному электрическому стимулятору. При этом величина стимула соответствовала амплитуде смещения границы растворов, а длительность стимула – длительности смещения. Первый параметр не имел значения для формы или величины тока. Ток в пейче определялся концентрацией агониста, длительностью аппликации (1 мс), числом и свойствами каналов и рецепторов.

Растворы

Для быстрой аппликации использовались растворы, отличные от нормального раствора Рингера. Это было связано с тем, что они не карбогенизировались (чтобы избежать образования пузырьков) и формулировались для стабилизации пейча. Контрольный раствор на основе HEPES содержал (в мМ): NaCl (140), CaCl₂ (2), KCl (1.5), MgCl₂ (1), HEPES (10) (pH доводилась до 7.2, осмолярность до 295 мОсм). Раствор агониста (ГАМК 1 мМ) делался на основе контрольного раствора в который, кроме ГАМК добавлялось дополнительно 10 мМ NaCl (pH доводилась до 7.2, осмолярность до 295 мОсм). Из-за разницы ионных концентраций при аппликации раствора агониста на открытый кончик электрода в нем возникал ток. Рост и затухание этого тока, определялись скоростью обмена растворов на кончике электрода. Это использовалось для рассчета 10-90 % времени обмена между контрольным и раствором агониста на пейче. Время обмена измерялось в конце каждого эксперимента, после того как разрывался пейч. Оно составляло в среднем 0,2 мс, что является удовлетворительным для использованной длительности аппликации (1 мс).

Токи, регистрируемые с outside-out пейчей, полученных с интернейронов и пирамидных клеток, использовались для сравнительного анализа биофизических свойств ГАМКергических рецепторов.