Взаимные превращения моносахаров в тканях.

Взаимопревращения триоз, тетроз, пентоз и гептозы мы рассмотрели при обсуждении гликолиза и пентозофосфатного пути окисления углеводов. Рассмотрим взаимопревращения гексоз. В основном, катаболизм большенства простых сахаров идёт по гликолитическому пути.

ØМанноза

Под действием гексокиназы манноза может превращаться в маннозо-6-фосфат:

АТФ АДФ

Манноза Маннозо-6-фосфат

гексокиназа

Далее:

Маннозо-6-фосфат Фруктозо-6-фосфат

Фосфоманнозо-

изомериза

ØФруктоза

На долю фруктозы приходится значительная часть поступающих с пищей углеводов. Обычное её дневное поступление составляет около 100г – как в виде свободного сахара, так и в виде компонента сахарозы. Большая часть потребляемой фруктозы метаболизируется печенью по фруктозо-1-фосфатному пути:

АТФ АДФ

Фруктоза Фруктозо-1-фосфат

Фруктокиназа

О

С СН₂ОН

Н

Фруктозо-1-фосфат Н – С – ОН + С=О

Фруктозо-1-фосфат-

Альдолаза СН₂ОН СН₂ОРО₃Н₂

Глицериновый Фосфодиокси-

альдегиз ацетон

 

 

С = О С = О

Н АТФ АДФ Н триозофосфатизомераза

Н – С – ОН Н – С – Н

Триозокиназа

СН₂ОН СН₂ОРО₃Н₂

Глицериновый 3-фосфоглицериновый

альдегиз альдегиз

 

в гликогиз

Фруктоза может превратиться и во фруктозо-6-фосфат под действием гексокиназы. Однако, сродство гексокиназы к глюкозе в 20 раз больше, чем к фруктозе и поэтому в печени, характеризующейся высоким содержанием глюкозы, имеет место лишь незначительное фосфорилирование фруктозы по фруктозо-6 –фосфатному типу. В то же время в жировой ткани, где содержание фруктозы значительно выше, чем содержание глюкозы, большая часть фруктозыметаболизируется во фруктозо-6-фосфат. Фруктозо-6-фосфат, в свою очередь, легко может переходить во фруктозу-1,6-дифосфат:

АТФ АДФ

Фруктозо-6-фосфат Фруктозо-1,6дифосфат

фосфофруктокиназа

И, далее, по пути гликолиза. Другой путь утилизации фруктозо-6-фосфата: переход ее в глюкозо-6-фосфат путем изомеразной реакции. А глюкозо-6-фосфат может использоваться, например, для каких-то синтетических процессов.

ØГалактоза.

Галактоза включается в этот процесс более сложным путем: она, как правило, не утилизируется с помощью гексокиназы:

АТФ АДФ

Галактоза Галактозо-1-фосфат

галактокиназа

Галактозофосфат-

уридилтрансфераза

+УТФ; -ПФ (у детей)

УДФ-галактоза

УДФ-галактозопирофосфорилаза

 

УДФ-глюкозо-эпимераза

(у взрослых) УДФ-галактоза

УДФ-глюкоза +

Галактозо-1-фосфат

При недостатке фермента: галактозофосфатуридилтрансфераза развивается тяжелая патология-галактоземия. Часто это генетические мутации. Развивается непереносимость к галактозе(содержащейся в молоке), цирроз печени, почек, катаракта (вследствие накопления многоатомного спирта галактита (дульцита), отставание в умственном развитии.

№3 Общие принципы выделения белков.

Для изучения белка (будь то определение его структуры или биологических функций) первым делом необходимо выделить белок в чистом виде. Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани), исследуемый материал тщательно измельчают, вплоть до разрушения клеточной структуры. Этот процесс называется гомогенизация. Для этого используются различного рода гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод «азотной бомбы “ (клетки насыщаются азотом под давлением, затем резко сбрасывают давление, а выделяющийся газообразный азот как бы "взрывает“ клетки). На следующем этапе из полученного гомогената тканей белки экстрагируют. Для экстракции белков широко применяются различные буферные смеси с определенным значением рН, органические растворители (водные растворы глицерина, слабый раствор глюкозы), различные ферменты, расщепляющие белково-липидные и белково-белковые связи (додецилсульфат натрия, дезоксихалат натрия и т.д.). После достижения полной экстракции белков (то-есть перевода в растворенное состояние), приступают к фракционированию белков, то-есть разделению смеси белков на отдельные белки. Часто фракционирование сочетается с идентификацией. Для этого используются различные методы:

1) электрофорез (различные виды: на бумаге, на геле, высоковольтный и т.д.). 2) ультроцентрифугирование 3) иммуно-химический анализ (антиген+антитело)

4) различные виды хроматографии 5) гельфильтрация.

Для последующей очистки белков от низкомолекулярных примесей используются методы диализа, гельфильтрации, кристаллизации, ультрафильтрации и т.д. Все эти методы основаны на разной растворимости, разной осаждаемости, величине (диализ, гельфильтрация), разности зарядов (электрофорез, ионообменная хроматография). Иногда используют разную биологическую активность (это при фракционировании и очистке ферментов). Но об этом легко говорить, однако осуществить трудно. В общем случае необходима многостадийная обработка исходного материала, на каждой из этих стадий удаляется большая часть постороннего материала, присутствующего в образце после предидущей стадии разделения до тех пор, пока искомый белок не будет получен в чистом виде, без примесей. Универсальной методики выделения для всех белков не существует. Хорошим считается результат, когда очистка проходит 5-6 стадий. Например, выделение галоктозосвязывающего белка из кишечной палочки (участвует в транспорте галактозы через мембрану) включает следующие стадии:

1) гомогенизирование 2) осаждение протамином (для удаления ДНК иРНК)

3) осаждение сульфатом аммония (высаливание – снижает растворимость белка).

4) хроматография на целлюлозе

5) хроматография на гидроксил-апатите

6) хроматография на сефадексе

Для определения степени очистки расчитывают удельную активность белка или используют метод аналитического центрифугирования. Очень эффективные методы:

1) афинная хроматография (1968 год – Анфинсен и сотрудники) – основан на специфическом связывании антиген-антитело.

2) изоэлектрофокусировка – использует различие в изоэлектрической точке белков (обычно используют полиакриламидный гель или агарозу) – на гель наносят слой белка, который мигрирует через области с различными рН, до тех пор, пока не достигнет изоэлектрического состояния.

ОТКРЫТИЕ БЕЛКОВ В РАСТВОРАХ.

Для открытия белков в растворах используют цветные реакции или реакции осаждения.

Цветные реакции различают двух типов:

1)универсальные, когда реагент реагирует с пептидной связью (биуретовая, нингидриновая) – эти реакции характерны для всех белков.

2)специфические – когда реагент дает окрашенные производные с какими-то определенными аминокислотами (реакция Фоля – на серусодержащие аминокислоты, реакция Миллона – на тирозин, ксантопротеиновая – азотная кислота взаимодействует с ароматическими аминокислотами, вызывая их нитрование – появляется желтое окрашивание).

Реакции осаждения делятся на необратимые (по сути, это – необратимая денатурация) и обратимые (высаливание). О денатурации мы уже говорили. Для высаливания применяются большие концентрации нейтральных солей: NaCl; (NH4)2SO4; MgSO4. При этом происходит дегидротация и снятие заряда, что является необходимым условием высаливания. На процесс высаливания влияет ряд факторов: молекулярная масса белка, гидрофильность, заряд белка и т.д.

МЕТОДЫ КОЛЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ.

Для количественного определения белка в растворе широко используются методы, основанные на использовании оптических свойств белков.

1)Рефрактометрический метод (прибор рефрактометр) – чем больше концентрация белка в растворе, тем на больший угол отклоняется луч света, пропущенный через раствор белка, что и фиксируется прибором.

2)Нефелометрический метод (прибор – нефелометр). Основан на свойстве белковых растворов рассеивать свет. Соответственно, чем выше концентрация белка в растворе, тем больше степень рассеивания света.

3)Спектрофотометрический метод (прибор – спектрофотометр). Основан на свойстве раствора белка поглощать свет в ультрофиолетовой части спектора. Чем больше белка в растворе, тем больше поглощение этим раствором ультрафиолетовых лучей, что и фиксируется прибором.

4)Поляриметрический метод (прибор – поляриметр). Основан на зависимости вращения плоскости поляризованного света, пропускаемого через белковый раствор, от концентрации белка.

5)Кроме методов, основанных на оптических свойствах белка, широко используется колориметрический метод. Суть метода: проводят цветную реакцию и через окрашенный раствор белка пропускают свет с определенной длинной волны. Часть света поглощается окрашенным раствором белка. Степень поглощения зависит от концентрации белка в растворе.

6)В тех случаях, когда невозможно прямое определение белка в растворе, используют азотометрический метод. То-есть определяют не белок, а азот в растворе. Зная, что среднее содержание азота в белке составляет примерно 16%, легко, определив количество азота, рассчитать, сколько в растворе содержалось белка.

БИЛЕТ 31

№1 Внемитохондриальное окислене проходит, в основном, в ретикуло- эндоплазматческой сети (фрагменты ретикулума называют микросомы). Часто эти процессы происходят с участием оксигеназ. Различают ди- и монооксигеназы. Работа диоксигеназ часто сопровождается разрывом циклических структур:

Общая формула работы диоксигеназ: R+О₂ → RО₂. Монооксигеназы катализируют присоединение одного атома кислорода, при этом не редко образуются гидроксогруппы, поэтому их иногда называют гидроксилазы. Упрощенная схема действия монооксигеназ:

RН₂+О₂+ХН₂(ко-фактор) → RНОН+НОН+Х (окисленная форма ко-фактора). В качестве ко-фактора могут выступать НАДН2, НАДФН2, аскорбиновая кислота и т.д. В этих часто принимает участие цитохромы Р450, В5, флавиновые ферменты. Важный пример монооксигеназной активности представляет группа ферментов, которые все вместе называются цитохромы Р450. В эукариотических клетках они обычно локализованы в мембранах ретикулума. Они названы так потому, что при связывании оксида углерода в их спектре появляется сильная полоса поглощения при 450 нм. Цитохромы Р450 могут действовать и на нормальные клеточные компоненты и на многие чужеродные соединения, в том числе и лекарства различной природы. Иногда цитохромы Р450 учасивуют при детоксикации различных чужеродных соединений. Однако, в некоторых случаях под действием цитохрома Р450 эти соединения превращаются в продукты с цитостатическими, мутагенными или канцерогенными свойствами. Возможно окисление с участием пероксидаз. Есть внутриклеточные образования – пероксисомы, в которых сконцентрированы пероксидазы. Механизм этого окисления:

RН₂ + ХООН → R + НОН + ХОН. Наиболее часто в качестве пероксидазы ыступает перекись водорода:

RН₂ + НОН → 2НОН + R Это типичная реакция для тканей.

Глютатионпероксидаза окисляет глютатион. Каталаза тоже относится к пероксидазам:

Н₂О₂ + Н₂О₂ → (каталаза) 2Н2О + О2.

В организме существует мощная антиоксидантная система защиты:

1) СОД (супероксид) катализирует реакцию О₂*- + О₂*- => О₂(-2) + О_2, затем О₂(-2) + 2Н⁺ => Н₂О₂. Эту реакцию установили в 1969 году И. Фридович и Дж. Мак-Корд. СОД обнаружена во всех типах аэробных клеток, что подтверждает ее роль в механизме самозащиты организма от токсического дейсствия кислорода. У анаэробов этот фермент отсутствует, что, вероятно, и объясняет токсичность кислорода для анаэробных клеток. В последнее время появились данные, что полиморфноядерные лейкоциты (гранулоциты) выделяют большое количество О₂*- в период активности дыхательных метаболических процессов, способствующих развитию их в фагоциты, которые участвуют в переваривании и разрушении чужеродных частиц, бактерий и других клеток.

Помимо уничтожения бактерий О₂*-, по-видимому, повреждает другие ткани, вызывая воспалительные процессы. Так ревматоидные артриты часто сопровождаются выбросом полиморфоядерных лейкоцитов в суставную сумку.

Для устранения воспалительных процессов было предложено использовать СОД как противовоспалительный препарат в виде инъекций.

2) Каталаза катализирует реакцию 2Н₂О₂ => 2Н₂О + О₂

Н₂О₂ обезвреживается и при действии пероксидаз:

3) Сильным антиоксиднтным действием обладают витамины: Е, С, К.

4) Некоторые аминокислоты (триптофан и фенилаланин).

5) Тиреоидные и стероидные гормоны, эстрогены.

6) Биологически активные пептиды (глютатион).

7) Серусодержащие ферменты, глютатион – S – трансфераза.

№2 Биохимия соединительной ткани.

Разнообразные виды соединительной ткани построены по одному принципу. В большой массе межклеточного основного вещества (протеогликанв и сетчатые гликопротеиды), распределены волокна (коллагеновые, Эластиновые, ретикулиновые) и разнообразные клетки (макрофаги, фибробрасты и специфичные).

СТ выполняет разнообразные функции:

1) опорная,

2) барьерная функция,

3) метаболическая функция (синтез в фибробластах химических компогненов ткани),

4) депонирующая – накопление меланина, репаративная,

5) участие в водносолевом обмене