![]() Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву ![]() Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Теоретические основы биокалориметрического метода анализа
1.3.1 Биокалорииетрический метод определения общего количества микроорганизмов Мезофильная аэробная и факультативно-анаэробная микрофлора наиболее широко распространена среди других форм микроорганизмов, и ее содержание является одним из основных показателей санитарно-гигиенической чистоты производства пищевых товаров. Экспресс методом определения КМАФАнМ в сельскохозяйственном сырье и продуктах питания является метод микрокалориметрии. В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в пищевых продуктах происходит потребление питательных веществ и выделение тепла в окружающую среду. Количество выделенного тепла пропорционально содержанию клеток и их физиологической активности. При помещении образца с пробой пищевого продукта в микрокалориметр типа Тиана-Кальве выделяющиеся тепло передается через теплопроводящую стенку кюветы микрокалориметра к тепломеру, а также частично рассеивается в окружающую среду. Зарегистрированное значение теплового потока q будет меньше истинного значения f на величину рассеянной тепловой мощности. Кроме того, изменения q будут запаздывать во времени на величину τ относительно изменений f. Согласно основному динамическому уравнению микрокалориметров типа Тиана-Кальве, связь между истинным и регистрируемым тепловыми потоками описывается следующей формулой:
f(t) = q*(t-τ) + K*ʄ *q*(t-τ)*dt
где К – постоянная величина, характеризующая скорость теплообмена между ячейкой и термоблоком. Скорость выделения тепла при жизнедеятельности микроорганизмов обычно значительно ниже, чем скорость распространения тепловой энергии к тепломеру. В этой связи для микробных клеток реализуется условие:
q*(t-τ) = f'(t)/К
Между удельным тепловым потоком и концентрацией клеток No микроорганизмов наблюдается зависимость вида:
f(t) = F* No*exp(m*t) + B* No
где F – среднее значение удельной тепловой активности делящихся клеток; В – среднее значение удельной тепловой активности не делящихся клеток; m – удельная константа скорости размножения клеток. Из вышеприведенных формул следует, что регистрируемый тепловой поток зависит от концентрации клеток микроорганизмов в соответствии с уравнением:
q*(t-τ) = F* No* m*exp(m*t)/К
No = К* q*(t-τ)/ F* m*exp(m*t)
Полученная формула связывает зарегистрированную прибором тепловую мощность с концентрацией клеток в исследуемом образце, параметрами микрокалориметра и характеристиками физиологической активности клеток. Для практического использования данной формулы необходимо предварительно провести градуировку микрокалориметра на пищевом продукте с известным содержанием клеток. Если содержание микроорганизмов в пищевом продукте находится в интервале 105-108 кл/см3, биокалориметрический анализ проводится в течение 30 минут. При оценке более низких концентраций бактерий необходимо предварительное выдерживание продуктов в термостате при температуре 30оС либо 37оС в течение 2,4,6 часов для дополнительного увеличения количества клеток. Если концентрация микроорганизмов в образце превышает 108 кл/см3, перед измерением проводится разведение образца до рабочего диапазона концентраций 105-108 кл/см3. ХОД РАБОТЫ. После перемешивания жидкого пищевого продукта отбирают 20 см3 образца, разливают его поровну в 4 стерильные пробирки. Первую пробирку с образцом используют для определения микроорганизмов в диапазоне концентраций 105-108 кл/см3. Три другие пробирки помещают в термостат, для определения более низких концентраций. Для микрокалориметрического анализа взятую пробу делят на две равные части и одну из частей подвергают тепловой обработке на кипящей водяной бане в течение 10 минут. После этого ее охлаждают и используют в качестве контрольной пробы, а необработанную часть – в качестве рабочей пробы. Рабочую и контрольную пробы заправляют в подготовленной к измерениям микрокалориметр, термостатированный при 30оС, и через 30 минут проводят отсчет показаний мощности теплопродукции клеток. Если полученная величина теплового потока превышает значение 15 кВт/см3, дальнейшие измерение прекращают и проводят расчет содержания микроорганизмов в образце. Общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяют по формуле:
N0 = q0/F,
где q0 – удельная мощность тепловыделения клеток микроорганизмов в анализируемом образце;
F – среднее значение коэффициента физиологической активности микроорганизмов, полученное в процессе градуировки микрокалориметра.
1.3.2 Биокалориметрический метод определения физиологической активности микроорганизмов Физиологическая активность клеток с точки зрения обмена веществ измеряется количеством питательных субстратов, потребляемых единицей микробной биомассы за единицу времени, или количеством образующихся продуктов и выражается зависимостью: А = a*m + b, где А – физиологическая активность; а – трофический коэффициент, показывающий затраты питательных веществ на образование единицы биомасс; m – удельная константа скорости роста численности клеток; b – коэффициент основного обмена, показывающий расход питательных веществ на подержания жизнедеятельности единицы биомассы за единицу времени. Поскольку для определенной культуры клеток при фиксированных условиях среды коэффициенты а и b постоянны, физиологическая активность клеток линейно связана с их ростовой активностью и зависят от удельной константы скорости роста. При интенсивном росте культуры клеток a*m При слабом росте культуры клеток a*m Так как различные процессы жизнедеятельности микроорганизмов сопровождаются выделением тепла, то мерой физиологической активности клеток с энергетической точки зрения может являться скорость их тепловыделения, которая отражает как интенсивность протекающих метаболических реакций, так и скорость размножения клеток. В основе биокалориметрии, как и других косвенных инструментальных метод анализа живых организмов, лежит зависимость величины регистрируемого сигнала от численности и физиологической активности клеток в анализируемом объекте. Для быстрого определения общего количества микроорганизмов в пищевых продуктах микрокалометрическим методом требуется предварительно оценить удельную тепловую активность клеток в образцах с известным содержанием микроорганизмов. Процесс установления соответствия между показаниями прибора и содержанием микроорганизмов в образце называется градуировкой микрокалориметра. Теплопродукция микроорганизмов в пищевых продуктах зависит как от численности клеток, так и от особенностей их метаболизма и ростовой активности. На нее также влияют химический состав, консистенция пищевых продуктов и физико-химические условия внешней среды. Для характеристики тепловыделения отдельного вида микроорганизмов может быть использована величина удельной теплопродукции клеток (Fi):
Fi = qi/Ni,
где qi – мощность тепловыделения клеток i-го вида; Ni – количество клеток i-го вида. Для устранения влияния видового состава микроорганизмов на тепловыделение образцов проводят усреднение удельной теплопродукции клеток:
F0 = (F1*N1 + F2*N2 + …Fi*Ni)/N0,
где F0 – среднее значение удельной теплопродукции клеток; N0 – общее количество микроорганизмов в образце. Поскольку усреднение проводится при наличии большого количества клеток, то получаются статистически хорошо воспроизводимые результаты анализа термогенеза микроорганизмов.
Влияние различий химического состава и консистенции продуктов на активность микрофлоры учитывается путем проведения процедуры градуировки. Для этого проводятся измерения теплопродукции образцов пищевых продуктов с известным содержанием микроорганизмов, определенным, например, методом посева на чашках. Возможно также устранение влияния химического состава и консистенции продуктов на активность микрофлоры путем перевода клеток микроорганизмов в универсальную питательную среду. В последнем случае это позволяет избежать влияния сезонных изменений химического состава пищевых продуктов на активность микроорганизмов. Влияние размножения клеток на процесс измерения теплопродукции микроорганизмов учитывают, если длительность измерений сравнима с удельной константой скорости размножения клеток, и определяют в предварительных испытаниях при градуировке микрокалориметра. ХОД РАБОТЫ. Отобранный образец (10 см3) натурального сборного сырого молока, поступающего на молокоперерабатывающие предприятия, разделяют на 2 части по 5 см3 и помещают в стерильные пробирки. Одну часть закрывают притертой пробкой и подвергают тепловой обработке на кипящей водяной бане в течение 10 минут для подавления жизнедеятельности микроорганизмов и используют в качестве контрольной пробы. После остывания до 30оС 1 см3 контрольной пробы заправляют в канал Б микрокалориметра, а в канал А помещают 1 см3 необработанной пробы молока. После заправки пробы термостатируют в микрокалориметре в течение 10 минут и затем проводят измерение стационарного значения теплопродукции клеток. Параллельно с проведением биокалориметрических измерений из пробы сырого молока отбирают 1 см3 и готовят ее десятикратное разведение в физиологическом растворе. Методом глубинного посева засевают по 1 см3 3-го и 4-го разведения в МПА. Для каждого разведения используют по 3 чашки Петри. После термостатирования чашек при 30оС в течение 3-х суток подсчитывают среднее значение числа выросших колоний (noi) для каждого разведения. Для подсчета содержания микроорганизмов в молоке отбирают чашки с числом колоний в диапазоне 30-300 колоний/чашку. Общее количество мезофильных аэробных и ифакультативно анаэробных микроорганизмов в методе посева на чашках для образца молока определяют по формуле:
N = (0,1*n01*w1 + n02*w2)/(V*f),
где f – максимальная степень разведения исходного образца; wi – весовая доля i-го разведения в среднем; V – объем пробы, вносимой на чашку Петри при посеве; noi - среднее число колоний, выросших на чашках для i-го разведения:
noi =
где Среднее значение физиологической активности бактерий в молоке определяют по формуле:
Метод основан на калориметрическом измерении тепловой мощности, выделяемой в процессе жизнедеятельности микрофлоры молока, которая является энергетической характеристикой ее физиологической активности. Аппаратура, материалы и реактивы: - микрокалориметры типа МКМ-Ц по ТУ 25-2477.0040; - термометры стеклянные жидкостные (не ртутные), диапазон измерения 0-100оС, цена деления шкалы 1оС по ГОСТ 28498; - стерилизатор паровой медицинский по ГОСТ 19569; - электропечь сопротивления лабораторная или шкаф сушильный, диапазон регулирования температуры от 50 до 200оС; - стаканчики для взвешивания (бюксы) типов СВ или СН по ГОСТ 25336; - шприцы медицинские типа «Рекорд» вместимостью 5 и 20 см3; - иглы инъекционные для шприцов типа «Рекорд»; - холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678; - пробирки типов П1 и П2 соответственно диаметром 16 мм, высотой 150 мм и диаметром 21 мм, высотой 200 мм по ГОСТ 25336; - спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962 или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300; - вода дистиллированная по ГОСТ 6709; - бумага фильтровальная по ГОСТ 12026; - пергамент по ГОСТ 1341. Подготовка к измерению. Кюветы микрокалориметра стерилизуют спиртом. Подготовку к работе и градуирование прибора (определение физиологической активности микрофлоры молока F) проводят в соответствии с требованиями технического описания и инструкции по эксплуатации микрокалориметра, прилагаемых к прибору. Тепловой поток микрофлоры молока проводят при температуре статирования 30 или 37оС, которую устанавливают переключателем «Температура». Объем (1 см3) вводимых в кюветы дистиллированной воды и молока контролируют по шкалам шприцов. Отобранную пробу молока перед исследованием тщательно перемешивают и разделяют пополам на две пробы №1 и №2, которые помещают в стерильную посуду с пробками. Затем пробу №1 пастеризуют при температуре (90±5)оС в течение не менее 15 минут. После окончания пастеризации эту пробу охлаждают до температуры (25±5)оС и заправляют стерильным шприцом в одну из кювет. Пробу №2 помещают в холодильник. Проведение измерений. Общее количество микроорганизмов в молоке определяют по величине теплового потока 1 см3 молока (0) с учетом значения физиологической активности его микрофлоры (F). Заправку одной кюветы пробой №1 проводят в трехкратной повторности с целью удаления из нее остатков дистиллированной воды или спирта. Третью порцию оставляют для измерения. Вторую сравнительную кювету оставляют с дистиллированной водой. В результате получают заправленную в микрокалориметр систему: дистиллированная вода – пастеризованное молоко, для которой регистрируют отсчет показаний базовой линии для пробы №1 с остановленным процессом метаболизма микрофлоры в молоке.
После окончания регистрации показаний базовой линии проводят перезаправку кюветы с пастеризованным молоком пробой №2 молока с естественным начальным уровнем физиологической микрофлоры в молоке. Заправку молока осуществляют стерильным шприцом в трехкратной последовательной повторности с целью вымывания остатков пробы №1. Третью порцию оставляют для измерения. В итоге получают систему: дистиллированная вода – молоко, для которой регистрируют отсчет показаний теплового потока Q. Обработка результатов. Теловой поток, выделяемый микрофлорой 1 см3 молока Q0, Вт/см3, вычисляют по формуле, используя измеренное значение теплового потока Q: Q0 = Q/ V, где Q – значение теплового потока, выделяемого микрофлорой в пробе №1 молока, Вт; V – объем пробы молока №2, введенный в кювету, см3. Общее количество микроорганизмов в 1 см3 молока No, 1*106 ед/см3, вычисляют по формуле: No = 1,15* Q0/ F, где Q0 – значение теплового потока, выделяемого микрофлорой 1 см3 молока, Вт/см3; F – среднее значение физиологической активности микрофлоры молока, Вт/1*106 ед; 1,15 – коэффициент, учитывающий прирост общего исходного количесвта микроорганизмов за время измерения теплового потока. Предел допускаемой погрешности результата определения общего количества микроорганизмов биокалориметрическим методом равен ±0,2* No в 1*106 ед/см3, с доверительной вероятностью Р=0,95.
|
|||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; просмотров: 265; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.14.255.254 (0.034 с.) |